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Dreidimensionale Zytometrie und Rekonstruktion des Reliefs roter Blutzellen im Reflexionskontrast
Inhalte:
Beim Reflexionskontrast handelt es sich um ein lichtmikroskopisches Beleuchtungsverfahren, welches in den 70iger Jahren von der Fa. Ernst Leitz in Wetzlar entwickelt wurde. Erste Publikationen über diese zum
damaligen Zeitpunkt neue mikroskopische Untersuchungsmethode erschienen in 1977. Der Reflexionskontrast erlaubt die Untersuchung biologischer Strukturen in Auflichtbeleuchtung unter Einsatz von Immersionsobjektiven
bei hoher Apertur und Vergrößerung. Die beleuchtenden Strahlen treffen schräg von lateral auf das Objekt, durch Reflexion, Absorption und Interferenzbildung entsteht der abbildende Strahlengang. Beleuchtender und
abbildender Strahlengang verlaufen jeweils durch das verwendete mikroskopische Objektiv. Ähnlich wie in der Fluoreszenzmikroskopie ist die Lichtausbeute des Reflexionskontrastes gering. Daher müssen hochenergetische
Beleuchtungseinrichtungen verwendet werden, um hinreichende Bildhelligkeiten zu realisieren.
Nicht planparallele opake Strukturen zeigen bei Beleuchtung im Reflexionskontrast Interferenzlinien, die für eine dreidimensionale quantitative Analyse des jeweiligen Objektes herangezogen werden können.
In Zusammenarbeit mit den Anatomischen Institut der Universität Bonn (Direktor: Prof. Dr. med. Kurt Fleischhauer, Bereichsleiter Lichtmikroskopie: Prof. Dr. med. Franz Pera) habe ich von 1978 – 1982 experimentelle
Arbeiten mit dieser neuen lichtmikroskopischen Untersuchungsmethode durchgeführt. Basierend auf wellenoptischen Berechnungen wurde eine Methode entwickelt, den Reflektionskontrast zur dreidimensionalen quantitativen
Analyse opaker Strukturen einzusetzen und maßstabsgerechte räumliche Rekonstruktionen des Oberflächenreliefs solcher Strukturen zu erstellen. Als Modell für die Entwicklung dieser Messmethodik dienten zunächst
normale menschliche Erythrozyten, im weiteren Verlauf auch sehr komplex deformierte pathologische Erythrozyten von Patienten mit hereditärer Sphärozytose, Sichelzellanämie und Thalassämie.
Am Beispiel dieser Erythrozyten, die in gefärbten und ungefärbten Blutausstrichpräparaten vorlagen, wurde ein Berechnungsmodell entwickelt, um das Oberflächenrelief der jeweiligen Zellen quantitativ zu beschreiben.
Es wurde herausgearbeitet, dass bei Verwendung von monochromatischem Grünlicht (Wellenlänge: 546 nm) der Abstand zweier gleichartiger Interferenzlinien einem Höhenunterschied von 226 nm entspricht. Basierend auf
dieser Messgröße wurden Methoden entwickelt, mittels kartographischer Zeichenapparate dreidimensionale Rekonstruktionen des Zellreliefs zu erstellen.
Ergänzend wurde ein Berechnungsverfahren entwickelt, durch vergleichende Untersuchung desselben Objektes mit veränderlicher Wellenlänge des beleuchtenden Strahlenbündels auf die absolute Schichtdicke rückzuschließen.
In weitergehenden Arbeiten wurden durch Eingriffe im mikroskopischen Strahlengang auch unmittelbar sichtbare dreidimensionale Darstellungen des Zellreliefs realisiert, welche interferenzmikroskopischen und
rasterelektronenmikroskopischen Bildern ähneln.
Die jeweiligen Einzelmessungen und dreidimensionalen Rekonstruktionen wurden in einem für lichtmikroskopische Darstellungen bemerkenswert hohen Vergrößerungsbereich von 10.000:1 vorgenommen.
Die erarbeitete Methodik wurde validiert durch Vergleichsmessungen mittels Raster-Elektronenmikroskop, Durchlicht-Interferenzmikroskop nach Mach-Zehnder und vergleichende Untersuchung von Mikrosphären bekannter Größe.
In Zusammenarbeit mit der angiologischen Abteilung der medizinischen Universitäts-Poliklinik Bonn (Leiter: Prof. Dr. G. Trübestein) wurde die erarbeitete Methodik bei Patienten mit arterieller Verschlusskrankheit,
Raynaud-Syndrom und perniziöser Anämie eingesetzt. Bei diesen Untersuchungen wurde auch eine semiautomatische Bildanalyse implementiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Verformbarkeit der Erythrozyten bei den
vorerwähnten Krankheitsbildern zunimmt. Dies könnte als möglicher zellulärer Kompensationsmechanismus gedeutet werden, um durch eine optimierte Erythrozyten-Rigidität zur Verbesserung der erkrankungsbedingt
gestörten Mikrozirkulation beizutragen.
Gefärbter Erythrozyt im Reflexionskontrast (Standardeinstellung)
Vergrößerung des Originalbildes: 10.000:1,
monochromatisches Grünlicht, Wellenlänge: 546 nm.
Dem Abstand zweier gleichartiger, d.h. heller oder dunkler
Interferenzlinien entspricht ein Höhenunterschied von 226 nm.
Vom Randwulst bis zum Zentrum ergibt sich hieraus im vorliegenden
Fall eine Tiefe der zentralen Eindellung von4x226 = 904 nm.
Gefärbte Erythrocyten im modifizierten Reflexionskontrast
(reale dreidimensionale Darstellung des Zellreliefs),
monochromatisches Grünlicht (s.o.).
Dreidimensionale Rekonstruktionen normaler und pathologischer Erythrozyten
Linke Spalte: Konventionelle Durchlichtbeleuchtung (Phasenkontrast)
Mittlere Spalte: Reflexionskontrast (Standarddarstellung)
Rechte Spalte: Maßstabsgerechte karthographische Rekonsruktionen
Oben: Ungefärbter Normozyt
Mitte: Gefärbter Sphaerozyt (Kugelzellenanämie)
Unten: Target-Zelle (Thalassämie).
Bedeutung:
Herkömmliche lichtmikroskopische Untersuchungen ermöglichen lediglich eine zweidimensionale Vermessung biologischer Strukturen. Eine dreidimensionale
Quantifizierung des Oberflächenreliefs von Zellen ist mit diesen Verfahren nicht möglich. Auch reale dreidimensionale Betrachtungen nach Art der
Raster-Elektronenmikroskopie erlauben die herkömmlichen lichtmikroskopischen Beleuchtungsverfahren nicht. Lediglich im Durchlicht-Interferenzkontrast lassen
sich dreidimensionale reliefartige Darstellungen erzielen; hier handelt es sich jedoch um pseudo-dreidimensionale Effekte, die von der optischen Dichte des Objektes bestimmt werden.
Mit dem Reflexionskontrast stand erstmalig eine Methode zur Verfügung, die nach den Gesetzen der Reflexion und Absorption reale räumliche Darstellungen im Lichtmikroskop ermöglichte. Die erarbeiteten wellenoptischen
Berechnungsverfahren bildeten die Grundlage, mit Hilfe des Reflexionskontrastes reale Vermessungen vertikaler Höhenunterschiede im Endbereich
lichtmikroskopisch möglicher Vergrößerungen zu realisieren. Im Unterschied zu den
elektronenmikroskopischen Verfahren erlaubt der Reflexionskontrast grundsätzlich auch die Untersuchung lebender zellulärer Strukturen.
Auf diese Weise war der Reflexionskontrast geeignet, die Lücke zwischen Licht - und Rasterelektronenmikroskopie zu schließen.
Projektbezogene Veröffentlichungen:
Pera, F., Piper, J.:
Quantitative Morphological Analysis of Erythrocytes by Reflection Contrast Microscopy.
Blut 41, 377 – 386 (1980), Springer-Verlag
Piper, J., Pera, F.:
Rekonstruktion des Oberflächenreliefs von Erythrocyten mit Hilfe der Leitz-Reflektionskontrasteinrichtung.
Leitz-Mitt.-Wiss. u. Techn., Bd. VII, Nr. 7, 230 – 234 (1980)
Pera, F., Piper, J., Kunde, V.:
Morphometrische Untersuchungen der Formänderung von Blutzellen während der Ausstrichpräparation.
Verh. Anat. Ges. 76, 147 – 148 (1982)
Wilgalis, M., Pera, F., Trübestein, G., Ludwig, M., Piper, J.:
Erythrocytenverformbarkeit mit semiautomatischer Bildanalyse und Reflexionskontrast-Verfahren bei arterieller Verschlusskrankheit,
Raynaud-Syndrom und perniciöser Anämie.
Deutsche Gesellschaft für Angiologie (1982)
Piper, J.:
Qualitative und quantitative morphologische Analysen normaler und pathologischer Erythrocyten im Reflexionskontrastmikroskop – Dissertation
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